Structures de noyau et de tige d'une lumière cyanobactérienne thermophile

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3389 (2022) Citer cet article

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Les cyanobactéries, les glaucophytes et les rhodophytes utilisent des phycobilisomes géants collecteurs de lumière (PBS) pour capter l'énergie solaire et la transmettre aux centres de réaction photosynthétique. Les PBS sont variés sur le plan de la composition et de la structure, et extrêmement complexes, ce qui pose un défi pour une compréhension globale de leur fonction. À ce jour, trois architectures détaillées de PBS par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) ont été décrites : un type hémiellipsoïde, un type bloc de rhodophytes et un type hémidiscoïde cyanobactérien. Nous rapportons ici les structures cryo-EM d'un noyau d'allophycocyanine pentacylindrique et d'une tige contenant de la phycocyanine d'un PBS hémidiscoïde cyanobactérien thermophile. Les structures définissent l'arrangement spatial des sous-unités protéiques et des chromophores, cruciaux pour déchiffrer le mécanisme de transfert d'énergie. Ils révèlent comment le noyau pentacylindrique est formé, identifient les interactions clés entre les protéines de liaison et les chromophores biline et indiquent les voies de transfert d'énergie unidirectionnel.

Les cyanobactéries, les glaucophytes et les rhodophytes utilisent un grand complexe soluble dans l'eau appelé phycobilisome (PBS) pour l'absorption de l'énergie solaire et le transfert d'énergie vers les protéines membranaires photosynthétiques (photosystème I et photosystème II ; PSI et PSII)1. Les PBS absorbent principalement la lumière visible à 490–650 nm, que le PSI et le PSII ont du mal à absorber (à titre exceptionnel, les cyanobactéries contenant de la chlorophylle f hébergent des PBS qui absorbent la lumière proche infrarouge2,3) (Fig. 1 supplémentaire). Le PBS est composé de phycobiliprotéines (PBP) telles que la phycoérythrine, la phycoérythrocyanine, la phycocyanine (PC) et l'allophycocyanine (APC). Les unités d'assemblage des PBP sont des sous-unités α et β qui ont des replis de globine et hébergent plusieurs chromophores linéaires de tétrapyrrole tels que la phycoérythrobiline, la phycourobiline, la phycoviolobiline et la phycocyanobiline (PCB)4. Les oligomères de ces sous-unités α et β interagissent avec des protéines de liaison non chromophorylées pour former des bâtonnets PC dans l'ensemble du complexe PBS. Cinq types de morphologie structurelle du PBS ont été signalés : hémidiscoïdal5,6,7, hémiellipsoïdal8, bloc-type9, tige-type10,11,12,13 et faisceau-type14. Les PBS hémidiscoïdaux ont des noyaux bicylindriques15,16, tricylindriques5 ou pentacylindriques3,17. La composition des PBP en ce qui concerne le nombre de bâtonnets, la structure globale des PBS et leur association avec le PSI et le PSII sont régulées par la disponibilité de la lumière et des nutriments11,18. Récemment, les structures tridimensionnelles (3D) de trois types de PBS ont été analysées par cryo-microscopie électronique (cryo-EM)19,20,21,22, et les détails de leurs noyaux tricylindriques et pentacylindriques et des voies de transfert d'énergie ont été révélés. Parce que les PBS sont variés sur le plan de la composition et de la structure et extrêmement complexes, des analyses structurelles et fonctionnelles des PBS chez différentes espèces sont essentielles pour la compréhension complète de leurs mécanismes de travail. De plus, ces structures fournissent une base pour comprendre plusieurs PBS cyanobactériens et peuvent être utilisées pour promouvoir l'utilisation efficace de l'énergie solaire23,24,25.

Ici, nous rapportons les structures du noyau APC pentacylindrique et de la tige PC de la cyanobactérie thermophile Thermosynechococcus vulcanus aux résolutions de 3,7 Å et 4,2 Å, respectivement. Bien que leurs structures globales soient extrêmement similaires à la structure PBS d'Anabaena sp. PCC 7120 (ci-après dénommé Nostoc 7120) signalé par la réf. 22, nous avons observé les différences dans leurs structures internes. Les structures ont révélé des différences dans le PBS hémidiscoïdal de différentes espèces et fournissent un mécanisme possible pour le transfert d'énergie d'excitation unidirectionnelle.

Le PBS de T. vulcanus NIES-2134 (ci-après dénommé T. vulcanus) a une structure hémidiscoïdale avec un noyau APC pentacylindrique et six bâtonnets PC, avec un poids moléculaire total d'environ 6 MDa22,26 (Fig. 2 supplémentaire). Le noyau et les bâtonnets comprennent des sous-unités α- (CpcA, ApcA, ApcD et ApcE) et β- (CpcB, ApcB et ApcF), et leur unité constitutive de base est un monomère αβ27. Les PCB sont liés de manière covalente aux résidus de cystéine conservés dans les sous-unités α et β via des liaisons thioéther28. On pense que les protéines de liaison dans le PBS contribuent non seulement à la stabilité structurelle du PBS, mais également à l'ajustement du niveau d'énergie des chromophores29. Les protéines de liaison de T. vulcanus sont classées comme lieur de tige (LR; CpcC); lieur tige-terminal (LRT; CpcD); lieurs de noyau de tige (LRC; CpcG1, CpcG2 et CpcG4); les lieurs noyau-membrane (LCM; ApcE), qui se lient aux trimères APC des cylindres noyaux PBS; ou des lieurs de noyau (LC; ApcC), qui se lient au noyau de PBS. Lorsque le PBS absorbe la lumière, l'énergie d'excitation est rapidement transférée (de l'ordre des picosecondes) aux chromophores dans les sous-unités à la surface de la membrane appelées émetteurs terminaux (ApcE [LCM] et ApcD) puis éventuellement au PSII et PSI30. Plusieurs structures cristallines aux rayons X de PC et d'APC de T. vulcanus ont été signalées, celles-ci ayant fourni des points de départ pour des discussions concernant les configurations structurelles globales possibles et les mécanismes de transfert d'énergie interne dans les PBS31,32,33,34,35,36,37.

Le noyau APC pentacylindrique (noyau PBS) et la tige PC ont été obtenus à partir de préparations de PBS, suivis d'un traitement de fixation par gradient (GraFix) 26,38 et d'un traitement tampon phosphate à faible concentration, respectivement. Pour l'imagerie cryo-EM, il est préférable d'éliminer les stabilisants très concentrés (dans ce cas, le stabilisateur était un tampon phosphate); cependant, cela favorise la dissociation des bâtonnets de PC du noyau de PBS à la fois dans les algues rouges et les cyanobactéries, y compris T. vulcanus. Bien que les bâtonnets de PC aient été liés au noyau de PBS dans le PBS préparé, la plupart des bâtonnets de PC ont été dissociés pendant le traitement GraFix (Fig. 2 supplémentaire). Les moyennes bidimensionnelles (2D) avec EM de coloration négative ont montré que le cylindre au bas du T. vulcanus PBS préparé comprend trois trimères APC. Comme rapporté par la réf. 22, les bâtonnets de PC dans les PBS de cyanobactéries sont considérablement moins interactifs que ceux des algues rouges19, et un traitement de réticulation avec du glutaraldéhyde pour empêcher la dissociation des bâtonnets de PC a aidé à maintenir la structure du noyau du PBS. Cependant, certaines des tiges de PC se sont dissociées du noyau de PBS. La raison de l'interaction plus faible des bâtonnets de PC dans le PBS cyanobactérien par rapport au PBS d'algues rouges est probablement due aux différences de morphologie du PBS. Dans les PBS d'algues rouges (types bloc et hémiellipsoïdal), il existe de nombreux bâtonnets de phycoérythrine (PE) densément emballés, ce qui suggère la possibilité de nombreuses interactions entre les bâtonnets. Cependant, les bâtonnets de PC du PBS cyanobactérien (type hémisiscoidal) sont disposés en éventail, indiquant qu'il y a moins d'interactions entre les bâtonnets de PC que pour les bâtonnets de PE des PBS d'algues rouges. La différence de morphologie suggère que le PBS cyanobactérien est plus sujet à la dissociation des bâtonnets de PC que le PBS d'algues rouges dans des conditions de tampon phosphate à faible concentration.

Les cartes Cryo-EM du noyau PBS et de la tige PC ont été reconstruites à des résolutions de 3, 7 Å et 4, 2 Å, respectivement, sur la base des critères de corrélation de coquille Gold Standard Fourier [FSC] de 0, 143 entre deux demi-cartes (tableau supplémentaire 1). Les modèles structurels ont été affinés par rapport aux cartes, ce qui a validé les résolutions ; une valeur FSC de 0,5 entre le modèle et la carte : 3,8 Å (noyau PBS) et 4,2 Å (tige PC) ; Estimations basées sur le Q-score39 : 3,6 Å (Q = 0,49 ; noyau PBS) et 4,0 Å (Q = 0,40 ; tige PC) (Figs. 3 et 4 supplémentaires et tableaux supplémentaires 1 à 3).

Le noyau PBS analysé de T. vulcanus montre une structure hémidiscoïdale à symétrie C2, composée de trois cylindres (A, A 'et B), de deux cylindres (C et C') avec quelques bâtonnets PC interagissant avec le noyau PBS (Fig. 1). La structure globale du noyau PBS était très similaire à celle du Nostoc 71207,22. La double symétrie stricte n'a pas été maintenue dans la partie externe des tiges de PC (Rb, Rb', Rt, Rt', Rs1, Rs1', Rs2 et Rs2')7, car bon nombre de ces parties se sont probablement dissociées du noyau lors de la préparation de l'échantillon (voir ci-dessus). La carte cryo-EM résout des parties des bâtonnets, mais la résolution locale des régions correspondantes varie de 7 Å à 20 Å (Fig. 3 supplémentaire). Ainsi, nous n'avons pas construit de modèles des tiges (Fig. 1c). Le noyau PBS est un supercomplexe de dimensions 110 × 210 × 300 Å et est composé de 38 ApcA, 40 ApcB, 6 ApcC, 2 ApcD, 2 ApcE (LCM), 2 ApcF et 84 PCB (Fig. 5 supplémentaire, tableau supplémentaire 4). Dans l'autre noyau PBS cyanobactérien, les cylindres A et B sont chacun constitués de quatre trimères APC, tandis que le noyau PBS de T. vulcanus comprend trois trimères APC dans le cylindre A et quatre trimères APC dans le cylindre B. ApcD a été identifié dans le quatrième trimère APC du cylindre A des autres PBS cyanobactériens, et ce trimère joue un rôle important dans le transfert d'énergie du PBS aux protéines membranaires photosynthétiques22. On considère que si l'arrangement d'ApcD est le même dans les PBS des cyanobactéries Synechococcus sp. PCC 7002 (ci-après dénommé Synechococcus 7002), Nostoc 7120 et T. vulcanus, puis T. vulcanus PBS doivent avoir un quatrième trimère APC dans le cylindre A. Cependant, le PBS préparé de T. vulcanus contient ApcD, et les moyennes 2D avec EM à coloration négative ont confirmé que le cylindre A était composé de trois trimères APC (Fig. 2a, c, d supplémentaires). Cela suggère que la disposition de l'ApcD dans le PBS de T. vulcanus diffère de celle du PBS chez d'autres espèces. À l'heure actuelle, nous ne comprenons pas clairement pourquoi T. vulcanus a trois trimères APC dans le cylindre A au lieu de quatre.

Carte Cryo-EM du noyau PBS des vues avant (a, c), latérales (b, e, f) et inférieures (d). c Il montre la superposition de la carte cryo-EM et du modèle de base PBS raffiné. e Ici, il montre la structure à l'intérieur du rectangle en a, agrandie et pivotée de 90˚. f Cela montre e tourné de 180˚. g Modèle schématique du noyau APC pentacylindrique (y compris les cylindres A (A'), B et C (C')) et des tiges PC (Rb, Rb', Rt et Rt'). ApcE (LCM) contenant α, Reps 1–4 et Arms 1–3 est affiché en rouge. Les tiges PC qui n'ont pas construit le modèle sont représentées en translucide. Les modèles de tige PC ont été dessinés en faisant référence à la carte cryo-EM de cette étude et à la structure PBS de Nostoc 71207. h Modèle schématique de la tige PC. CpcC (LR), CpcD (LRT) et CpcG (LRC) interagissent dans les deux hexamères PC. L'identification d'ApcD est provisoire. ApcD est indiqué entre parenthèses (ApcD).

Le cylindre A est composé des sous-unités α des phycobiliprotéines (ApcA, ApcD et ApcE [LCM]), des sous-unités β des phycobiliprotéines (ApcB et ApcF) et de l'ApcC (Lc). Le cylindre A (A') se compose de trois trimères APC (A1, A2 et A3) avec des sous-unités ApcD/ApcB et deux ApcA/ApcB (A1) ; trois ApcA/ApcB (A2); et ApcE/ApcB, ApcA/ApcF et ApcA/ApcB (A3), respectivement (Fig. 2a). L'analyse électrophorétique montre que l'ApcD est présent dans les PBS préparés (Fig. 2c supplémentaire) 26, mais l'ApcD n'a pas pu être identifié sur la carte cryo-EM en raison de la résolution limitée. Nous avons ensuite provisoirement attribué ApcD à une sous-unité qui ne pouvait pas être identifiée comme ApcA dans cette étude (cependant, nous avons identifié ApcA plutôt que ApcD dans le modèle structurel [code PDB : 7VEA]) (Fig. 6 supplémentaire). Le cylindre B est constitué de quatre trimères APC consistant en ApcA et ApcB (B1, B2, B1' et B2'). De plus, LC interagit avec un côté des cylindres A et C, alors qu'il interagit avec les deux côtés du cylindre B. Le cylindre C est constitué de deux trimères APC, ApcA et ApcB, qui correspondent à un demi-cylindre B.

ApcE (LCM) est un émetteur terminal situé à la surface de la membrane dans le cylindre A et transfère l'énergie au PSII. ApcE (LCM) se compose de αLCM, et l'un de ses domaines présente une structure similaire à ApcA, quatre motifs répétés nommés «répétitions» (Rep1–Rep4) et «bras» (Arm1–3) qui relient les motifs. Rep1 interagit avec ApcF, deux ApcA (α2 et α3) et un ApcB (β1) dans A1 (Fig. 2b). Bien que les ApcE (LCM) des deux PBS d'algues rouges et du Synechococcus 7002 PBS ne contiennent pas de Rep4, les écarts quadratiques moyens (RMSD) de Rep1 – Rep4 dans les ApcE (LCM) de chaque espèce sont faibles et l'identité de séquence de Rep1 – Rep4 des cyanobactéries a tendance à être élevée (tableau supplémentaire 5). Cela suggère que la structure et la fonction de chaque Rep sont similaires, malgré la différence d'espèce.

a Disposition des émetteurs terminaux (αLCM d'ApcE [LCM] et ApcD), ApcF et des protéines de liaison (ApcE [LCM] et ApcCs). b Structures du trimère APC (A3) et Rep1 de l'ApcE (LCM) dans un cylindre. c Structures des trimères APC A1 et A2, ApcC et Rep2 d'ApcE (LCM) dans un cylindre. d Structures des trimères APC B1 et B2, ApcC, Rep3 et Arm3 de ApcE (LCM) dans le cylindre B. e Structure des trimères APC C1 et C2, ApcC et Rep4 de ApcE (LCM) dans le cylindre C'. f Superposition de quatre structures Rep (Reps1–4). Les lignes pointillées indiquent les hélices α dans les régions Rep. Rep1, vert ; Rep2, rouge ; Rep3, bleu ; Rep4, cyan.

Dans les structures d'algues rouges récemment rapportées, ApcC interagit avec Rep1 de ApcE (LCM), alors que ApcC et (ApcD) pourraient interagir avec Rep2 du noyau PBS de T. vulcanus, ce qui suggère que l'interaction entre les sous-unités du noyau diffère également entre les espèces. Rep3 d'ApcE (LCM), avec ApcC, contribuent au maintien de la structure et de la fonction des deux trimères APC dans le cylindre B. Arm3 s'étend à Rep4, qui sert de domaine de liaison du cylindre C. Rep4 interagit avec ApcC de la même manière que Rep2 et Rep3, ce qui signifie que chaque cylindre du noyau PBS contient un ApcC (Fig. 2c – e). Une caractéristique intéressante de Reps1–4 dans ApcE (LCM) est que les structures des régions d'hélice α sont similaires, alors que les structures des régions de boucle diffèrent (Fig. 2f). L'identité de séquence entre les Reps n'est pas élevée (Fig. 7 supplémentaire), ce qui suggère non seulement que les Reps1 à 4 maintiennent la structure de chaque cylindre, mais également que des résidus d'acides aminés distincts dans chaque Rep autour du PCB pourraient contribuer au transfert efficace de l'énergie lumineuse absorbée vers les émetteurs terminaux. Arm3, Rep4 d'ApcE (LCM) et le cylindre C ne sont pas présents dans le noyau PBS des algues rouges19,20 ou Synechocystis6, alors que ces composants sont présents dans environ la moitié des cyanobactéries si les domaines ApcE (LCM) sont cartographiés à l'arbre phylogénétique des principales espèces de cyanobactéries (Figs. 8 et 9 supplémentaires). Ainsi, commun à de nombreuses espèces d'algues, y compris les cyanobactéries, le cylindre C, Rep4 et Arm3, qui maintiennent le cylindre C lui-même, doivent jouer un rôle clé dans la collecte de la lumière. ApcE (LCM) est l'une des protéines de liaison les plus importantes pour le transfert d'énergie vers PSII1. La structure de T. vulcanus PBS décrite dans cette étude fournit un point de départ pour comprendre l'architecture des composants et les réseaux organisationnels pour les mécanismes de travail généraux des PBS dans le grand groupe des algues.

L'absence du "quatrième trimère APC" dans le cylindre A de T. vulcanus PBS peut être attribuée au fait que ApcC interagissant dans le trimère APC est incapable d'interagir avec Rep1 dans ApcE. Il existe deux principaux types de conformation (type I et II) dans ApcC du PBS présent dans Nostoc 7120 et Synechococcus 7002. ApcC qui interagit avec Reps2–4 est de type I, tandis que l'ApcC qui interagit avec Rep1 est de type II (Fig. 10 supplémentaire). Les structures d'ApcC (Types I et II) de Nostoc 7120 et Synechococcus 7002 sont similaires (RMSD : 0,78 [Type I] et 0,74 [Type II]). En revanche, chez T. vulcanus PBS, ApcC interagissant avec Reps3–4 est de type I, mais ApcC interagissant avec Rep2 n'est ni de type I ni II (c'est-à-dire de type III). La comparaison des types II et III a révélé une disposition différente des régions de boucle dans ApcC (résidus 9 à 26, Fig. 10c supplémentaire) et une RMSD légèrement plus grande entre les types I et III (1,7). Bien que les séquences d'acides aminés de Reps1–4 et d'ApcC soient similaires dans les trois cyanobactéries (Fig. 10d supplémentaire), l'environnement autour de Rep2 dans le PBS de T. vulcanus peut modifier l'interaction d'ApcC par rapport à celle des autres cyanobactéries. Cela suggère que l'environnement entourant Rep1 dans T. vulcanus PBS ne permet pas l'interaction ApcC, et par conséquent, le "quatrième trimère APC" est incapable d'interagir avec Rep1.

L'énergie d'excitation est transférée aux émetteurs terminaux (ApcE [LCM] et ApcD) via des chromophores dans les cylindres B et C (C'), et l'énergie est finalement transférée au PSII et au PSI. T. vulcanus a le PCB comme seul chromophore, et c'est l'environnement protéique autour de chaque chromophore qui doit être intimement impliqué dans le transfert de l'énergie excitée vers les émetteurs terminaux. En effet, les résidus d'acides aminés avec des groupes polaires/chargés affectent l'énergie d'absorption des pigments40.

La figure 3 montre chaque cylindre qui constitue le noyau PBS, les chromophores dans le noyau et les distances entre les chromophores. En général, l'énergie d'excitation est transférée entre des paires proches de chromophores, c'est-à-dire le donneur (D) et l'accepteur (A) (Förster Resonance Energy Transfer; FRET)41,42. Cependant, le transfert d'énergie entre les chromophores dans le PBS ne peut pas être expliqué par le mécanisme FRET seul, car des signaux de cohérence photoexcités indiquant un couplage exitonique ont été observés à la fois dans PC et APC43,44. De plus, des expériences récentes ont révélé une nouvelle caractéristique, dans laquelle les excitations sont partagées de manière cohérente entre les molécules donneuses et acceptrices lors du transfert d'énergie45. De plus, des études antérieures suggèrent qu'un couplage excitonique d'une certaine forme peut se produire, même à une distance allant de 20 Å à 30 Å, permettant au PBS de transférer de l'énergie à haut rendement29,46. MacColl46 a rapporté un couplage excitonique entre les deux chromophores du trimère APC situés à proximité à travers l'interface monomère-monomère, et cette forte interaction induit un exciton vers un décalage vers le rouge dans le spectre d'absorption. Bien que les preuves soutiennent les deux mécanismes, la fluorescence ultrarapide résultant d'un certain nombre d'approches indique maintenant que le mécanisme de couplage excitonique est plus plausible ; cependant, bien que le modèle structurel obtenu dans cette étude permette une interprétation de l'arrangement et de l'orientation des chromophores dans le PBS et de leurs interactions environnantes (en particulier avec les protéines de liaison), le modèle structurel seul ne permet pas une interprétation complète du couplage excitonique entre chromophores voisins. La protéine de liaison stabilise non seulement la structure du PBS, mais modifie également les propriétés d'absorption/émission du chromophore et peut même créer l'environnement nécessaire à la liaison des excitons entre les chromophores29. Dans cette étude, nous proposons la voie de transfert d'énergie basée sur la distance entre les chromophores et leur orientation sur les chromophores qui interagissent avec les protéines de liaison.

a Voies de transfert d'énergie possibles dans et entre les cylindres B et C (C'). b Voies de transfert d'énergie possibles dans et entre les cylindres A et C. c Chemins de transfert d'énergie possibles entre les cylindres A (A') et B. d–g Les chromophores et les résidus d'acides aminés environnants d'ApcE (LCM). Les nombres près des lignes pointillées indiquent les distances (Å) entre les paires de PCB. Dans e–g, les lignes pointillées (noires et vertes) indiquent les liaisons hydrogène et les lignes pointillées (bleues) indiquent les liaisons covalentes entre le PCB et le résidu cystéine. Dans les résidus d'acides aminés (Phe992/ApcE et Cys84/C1) en d, les directions des atomes de Cα à Cβ dans les résidus sont indiquées par les objets en forme de capsule. L'identification d'ApcD est provisoire et le chromophore dans ApcD (A1αApcD81) est indiqué entre parenthèses.

Il existe quatre facteurs principaux associés au taux de transfert d'énergie d'excitation par le mécanisme FRET : (i) la distance entre D et A ; (ii) le facteur d'orientation, κ2, qui est un facteur qui décrit l'orientation relative des dipôles de transition de D et A dans l'espace (Fig. 11 supplémentaire) ; (iii) l'intégrale de chevauchement entre les spectres de fluorescence et d'absorption de D et A, respectivement ; et (iv) rendement quantique de D en l'absence de A. Pour un pigment en rotation libre D et A, κ2 a une valeur moyenne de 2/3, et les valeurs de κ2 représentant les chromophores significatifs sont d'environ 1 à 3 (tableau supplémentaire 6, figures supplémentaires 11 et 12). Cela indique qu'un transfert d'énergie est susceptible de se produire entre leurs chromophores dans le noyau PBS. Le rendement est inversement proportionnel à la sixième puissance de la distance entre D et A par couplage dipôle-dipôle ; ainsi, plus la distance entre les chromophores est courte, plus le taux et l'efficacité du transfert d'énergie entre eux sont élevés. Par conséquent, l'efficacité du transfert d'énergie entre les cylindres dépend également fortement de la distance entre les chromophores proches.

Les chromophores du noyau PBS sont numérotés selon la nomenclature de ceux de l'algue rouge19,20, et leurs noms sont définis comme suit : nom du cylindre (A, B ou C), type de sous-unité (α ou β) et nombre de résidus de cystéine (84) auxquels le chromophore est lié (Fig. 13 supplémentaire). Encore une fois, nous réitérons que les structures PBS d'algues rouges décrites précédemment ne contiennent pas de cylindres C19,20. Les chromophores impliqués dans le transfert d'énergie entre ou à l'intérieur de chaque cylindre sont illustrés à la Fig. 3a – c. Le transfert d'énergie du cylindre C (C ') vers les cylindres B et A (A ') se produit via C1α184 – B1α284 (33 Å) et C2α384 – A2α384 (35 Å), respectivement (Fig. 3a, b). Dans la structure actuelle, le cycle D du PCB dans de nombreux ApcB forme des interactions π – π avec les résidus tyrosine (Y90), mais le cycle D de C1β384 interagit probablement avec Phe992 dans la région de la boucle (résidus 990–997) de Rep4 dans l'ApcE (Fig. 3d). De plus, C1β384 interagit avec S1122/ApcE. Ces interactions contribuent probablement au transfert d'énergie du cylindre C (C') vers le cylindre B. Dans le PBS cyanobactérien avec des tiges PC liées (Rt, Rb, Rs1 et Rs2)7,22,26, l'énergie reçue par les tiges PC est censée être transférée aux cylindres B et A (A') via le cylindre C (C'), indiquant que le cylindre C (C') agit comme un intermédiaire pour le transfert d'énergie des tiges PC vers les émetteurs terminaux.

Le cylindre B est constitué de quatre trimères APC, avec deux trimères APC (B2 et B2') interagissant l'un avec l'autre. Cela indique que le transfert d'énergie dans le cylindre B est médié par B2β284 – B2'β184 (27 Å), B2β184 – B2'β184 (29 Å) et B2β384 – B2'β84 (27 Å) (Fig. 3a). Le transfert d'énergie du cylindre B vers le cylindre A (A') semble impliquer B1'α384–A1αApcD81 (33 Å) et B2α284–A3'α384 (34 Å) (Fig. 3c). De plus, il existe une interaction entre les cylindres A et A ', suggérant que le transfert d'énergie se produit via A2α284 – A3'α384 (32 Å). Ces chromophores interagissent avec Rep3 et Rep4 d'ApcE, et les compositions de résidus d'acides aminés d'ApcE diffèrent autour de chacun des quatre chromophores (C1β384, B2β384, B2β284 et B2β184) (Fig. 3d – g). Trois chromophores (B2β384, B2β284 et B2β184) interagissent avec les résidus d'acides aminés dans Rep3/ApcE, modifiant de manière significative la structure périphérique de chaque chromophore. B2β384 forme des liaisons hydrogène avec des résidus d'asparagine (N809/ApcE et N835/ApcE), et des acides aminés basiques (R761/ApcE et K890/ApcE) sont présents près de B2β284. B2β184 interagit avec un résidu basique (R730/ApcE) et est entouré d'acides aminés hydrophobes (L873/ApcE, T872/ApcE et F878/ApcE). Cette différence dans l'environnement protéique autour de chaque chromophore peut définir leur niveau d'énergie individuel.

On pense que trois PCB dans le cylindre A (A2α384, A2α284 et A3α384) sont les chromophores clés qui reçoivent l'énergie d'excitation des cylindres B et C en fonction de leur disposition spatiale (Fig. 3b), qui la transmettent ensuite au chromophore (A3αLCM198) dans les émetteurs terminaux. Dans ce cas, l'énergie d'excitation est très probablement transférée via les quatre chromophores (A2α184, A2β384, A3β184 et A3β284) proches de ces deux chromophores. Trois des quatre chromophores interagissent avec Rep1 ou Rep2, dans une structure caractéristique (Fig. 4a – c). La valeur κ2 et la distance entre les chromophores suggèrent également que l'efficacité du transfert d'énergie de A3αLCM198 – A3βApcF82 est la plus élevée parmi toutes les paires identifiées (tableau supplémentaire 6).

a, b Chromophores dans le trimère APC A3 et leur interaction avec Rep1 d'ApcE. c Chromophore dans le trimère APC A2 et son interaction avec Rep2 d'ApcE. d Chromophore d'ApcF et son interaction avec Rep1 d'ApcE. e Chromophore d'ApcE et son interaction avec ApcF. Les lignes pointillées (noires) indiquent les liaisons hydrogène. Les lignes pointillées (bleues) indiquent des liaisons covalentes entre le PCB et le résidu de cystéine. Les résidus d'acides aminés pour lesquels l'arrangement des chaînes latérales ne peut pas être affiché avec précision sont indiqués par des objets en forme de capsule. Les directions des atomes de Cα à Cβ dans les résidus sont indiquées par les objets en forme de capsule.

A3β184 interagit avec Y306/ApcE et est entouré d'acides aminés aromatiques (Y428/ApcE et F432/ApcE). A3β284 interagit avec S348/ApcE et R366/ApcE, et F373/ApcE est proche du cycle D de A3β284. De plus, A2β384 interagit avec R630/ApcE et est entouré de trois acides aminés aromatiques (Y455/ApcE, Y610/ApcE et F637/ApcE), avec F637/ApcE proche du cycle D de A2β384. Il a été noté que, dans la structure des PBS d'algues rouges, les acides aminés aromatiques sont abondants au voisinage des chromophores et il a été proposé qu'ils régulent l'état énergétique de chaque chromophore pour obtenir un transfert d'énergie unidirectionnel. Les acides aminés aromatiques dans les protéines de liaison de T. vulcanus PBS peuvent fonctionner de manière similaire, ce qui suggère que l'environnement protéique autour des trois chromophores est optimisé pour un transfert efficace de l'énergie d'excitation vers les deux chromophores.

Le chromophore A3βApcF82 dans ApcF se lie à C82/ApcF ainsi qu'à C416/ApcE et interagit avec quatre résidus d'acides aminés (Y265/ApcE, R84/ApcF, R77/ApcF et R78/ApcF). Cette interaction peut aider à régler le niveau d'énergie de A3βApcF82 pour former la voie de transfert d'énergie de A3βApcF82 à A3αLCM198. L'environnement autour de A3βApcF82 dans ApcF et A3αLCM198 dans ApcE peut être l'un des éléments critiques impliqués dans le transfert de l'énergie d'excitation unidirectionnelle vers PSI et PSII. Soulier et Bryant ont rapporté que les interactions entre les PCB liés aux sous-unités α et β du monomère APC adjacent dans le trimère APC sont responsables du décalage vers le rouge dans l'absorption du chromophore47. Dans le PBS de T. vulcanus, la distance entre A3βApcF82 et A3αLCM198 est de 20 Å, suggérant que les deux chromophores pourraient former un couplage excitonique qui transfère finalement l'énergie d'excitation au PSI et au PSII. ApcD est un émetteur terminal qui transfère de l'énergie au PSI48,49,50, et les résultats de la présente étude suggèrent que A1αApcD81 forme un couplage excitonique avec le A1β184 voisin et transfère l'énergie d'excitation au PSI.

Nous n'avons pas été en mesure d'identifier les chaînes latérales de trois résidus d'acides aminés (W166/ApcE, D163/ApcE et K159/ApcE), car la carte cryo-EM autour de A3αLCM198 était quelque peu désordonnée (Fig. 4e et Fig. 3e supplémentaire). Néanmoins, la structure actuelle suggère que A3αLCM198 dans ApcE pourrait former une interaction π – π avec W166 / AcpE, car le cycle D des résidus PCB et tyrosine dans ApcA forment généralement une interaction π – π. Ce résidu de tryptophane (Trp) est conservé dans l'ApcE de toutes les espèces répertoriées dans la Fig. 9 supplémentaire. Tang et al.51 ont analysé la structure cristalline (code PDB : 4XXI) de la région α dans l'ApcE de Nostoc 7120, signalant que l'interaction de ce Trp avec le chromophore est un facteur du décalage vers le rouge dans l'adsorption du chromophore. De plus, 4XXI est un homodimère et Trp dans un monomère forme une interaction π – π avec l'anneau D du chromophore, tandis que Trp dans un autre monomère est positionné perpendiculairement à l'anneau D du chromophore formant une interaction cation – π avec Arg160 à proximité (Fig. 5).

a Structure cristalline de Nostoc 7120 ApcE à une résolution de 2,2 Å. b Structure Cryo-EM de l'algue rouge P. purpureum ApcE à une résolution de 2,8 Å. c Structure Cryo-EM de l'algue rouge G. pacifica ApcE à une résolution de 3,5 Å. d Structure Cryo-EM de la cyanobactérie Synechococcus 7002 ApcE à une résolution de 3,5 Å. e Structure Cryo-EM de la cyanobactérie Nostoc ApcE à une résolution de 3,9 Å. f Structure Cryo-EM de la cyanobactérie T. vulcanus ApcE à une résolution de 3,7 Å. Ces structures ApcE ont été superposées avec leur carte de densité profilée à 1σ (a), 3σ (b), 2σ (c), 5σ (d), 3σ (e) et 3σ (f). Les résidus d'acides aminés pour lesquels l'arrangement des chaînes latérales ne peut pas être affiché avec précision sont indiqués par des objets en forme de capsule. Les directions des atomes de Cα à Cβ dans les résidus sont indiquées par les objets en forme de capsule.

Pour déterminer si l'interaction π – π est également formée dans les structures PBS résolues par cryo-EM19,20,22, nous avons évalué la région α dans l'ApcE des structures PBS et avons constaté que seul P. purpureum PBS présentait des interactions π–π claires entre l'anneau D du chromophore et Trp154/ApcE, alors que G. pacifica PBS a été modélisé pour former une interaction π–cation entre l'anneau D du chromo. phores et Arg152/ApcE. Cela est dû à la qualité des cartes cryo-EM obtenues, car les interactions π – π ne peuvent pas être clairement indiquées dans les structures PBS, à l'exception de celle de P. purpureum PBS. Cependant, étant donné que les interactions π – π contribuent au décalage vers le rouge de l'absorption du chromophore, il est fort probable que l'anneau D du chromophore et Trp forment des interactions π – π dans toutes les structures PBS, indiquant que cette caractéristique est probablement importante pour le transfert d'énergie de A3αLCM198 vers PSII. De plus amples détails concernant A3αLCM198 et les interactions clés avec les structures environnantes nécessiteront une structure à plus haute résolution du PBS et/ou une structure supercomplexe interagissant avec le PBS et le PSII. De plus, les résidus d'acides aminés proximaux de A3αLCM198 présentaient de légères différences entre les espèces (Fig. 5). Dans le PBS de T. vulcanus, le résidu d'acide aminé correspondant à Tyr79/ApcF était Tyr (G. pacifica et P. purpureum), Leu (Nostoc 7120) et Phe (Synechococcus 7002) dans chaque espèce. Ce résidu est situé à une distance de l'anneau chromophore qui rend peu probable la formation d'une interaction π – π ; cependant, cela peut affecter la propriété d'absorption du chromophore car les résidus d'acides aminés polaires/chargés affectent l'énergie d'absorption des pigments40.

La tige PC est formée de monomères PC constitués d'une sous-unité α (CpcA) et d'une sous-unité β (CpcB) pour former deux hexamères PC (Fig. 6a), à l'intérieur desquels les protéines de liaison interagissent. CpcC, CpcD, CpcG1, CpcG2 et CpcG4 ont été identifiés comme protéines de liaison du PC dans les PBS de T. vulcanus (Fig. 2 supplémentaire) 26, et nous pourrions attribuer CpcC, CpcD et CpcG2 dans la carte cryo-EM de la tige PC (Fig. 6b, c). Comme CpcG1, CpcG2 et CpcG4 présentent des séquences d'acides aminés similaires (Fig. 14 supplémentaire), l'attribution de CpcG2 dans cette étude est provisoire. Comme observé, les tiges de PC sont dissociées du PBS préparé et, par conséquent, la carte cryo-EM obtenue représente la reconstruction 3D à l'aide de particules combinées à plusieurs CpcG (CpcG1, CpcG2 et CpcG4). Lors de l'analyse d'une seule particule, la classification 3D peut être utilisée pour classer les particules étrangères et hétérogènes ; cependant, les structures globales de CpcG1, CpcG2 et CpcG4 sont extrêmement similaires, ce qui a rendu impossible la classification des particules avec chaque CpcG à une résolution de 4,2 Å.

Dans le Nostoc 7120 PBS, lorsque trois gènes codant pour CpcG (CpcG1, CpcG2 et CpcG4) ont été supprimés, les bâtonnets PC ne pouvaient pas se lier au noyau PBS7. Lorsque l'un des gènes codant pour CpcG était supprimé, les bâtonnets de PC pouvaient interagir avec le noyau de PBS, mais pas de la même manière que le PBS de type sauvage. Ceci suggère que la composition de la protéine CpcG est différente dans chaque PC rod7. La carte cryo-EM a montré les protéines de liaison s'étendant des tiges de PC interagissant avec le noyau de PBS. Bien que la qualité de la carte cryo-EM soit insuffisante pour construire un modèle structurel, la forte identité des séquences d'acides aminés suggère que l'arrangement des CpcG de T. vulcanus est similaire à celui de Nostoc 7120 (Fig. 15 supplémentaire)7,22. La région C-terminale de la protéine CpcG dans Rt (Rt') et Rb (Rb') interagit principalement avec la région périphérique du cylindre B et la région périphérique du cylindre A (A'), respectivement. La région C-terminale de CpcG interagit faiblement avec les cylindres du noyau PBS et supporte également une tige.

L'interaction entre les PC et les protéines de liaison dans la tige PC est asymétrique (Fig. 6), ce qui est induit par les interactions entre CpcC, CpcD et CpcG2 dans la tige. Pour étudier en quoi la tige de PC identifiée par cryo-EM dans cette étude diffère des structures de tige de PC décrites précédemment, nous avons superposé la tige de PC résolue par cristallographie aux rayons X32. Nous avons superposé le squelette Ca du polypeptide dans le PC monomère 1 (constitué de la chaîne A et de la chaîne B) à ceux correspondants dans T. vulcanus (3O2C) et Nostoc 7120 (7EYD). Ensuite, les RMSD entre les autres monomères PC ont été estimés, tout en conservant l'ensemble de la disposition des tiges PC. Bien qu'il n'y ait pas eu de différences majeures dans la structure de chaque monomère PC comprenant les bâtonnets PC, l'interaction des protéines de liaison dans les bâtonnets PC a provoqué un changement significatif dans la disposition du disque B dans le bâtonnet PC.

La superposition de la tige PC résolue par cryo-EM et cristallographie aux rayons X (code PDB : 3O2C ; la structure PC de T. vulcanus) a révélé que la modification de la disposition des monomères PC (monomères 1 à 12) dans la tige PC était principalement causée par l'interaction avec les protéines de liaison (Fig. 7 et tableau supplémentaire 7). La RMSD entre les monomères 1 dans le disque A (Fig. 7a) est petite (0, 55 Å), tandis que celle entre les monomères 3 est grande (2, 60 Å) en raison de l'interaction entre les régions CpcD (résidus 55–65 [rouge] et 68–74 [vert]) et les régions CpcB (résidus 109–122 [orange]) dans le monomère 3 (Fig. 7a). Le RMSD entre le monomère 2 est le plus grand dans le disque A (4,06 Å) (Fig. 7a), ce qui suggère que le changement dans l'arrangement du monomère 3 a été causé par le changement dans l'arrangement du monomère 2, qui était nécessaire pour maintenir l'interaction entre les monomères 2 et 3. Dans le disque A (Fig. 7b), le RMSD entre le monomère 4, qui est situé sur le côté inférieur du monomère 1, est aussi petit que celui des monomères 1 (0. 76 Å) (Fig. 7b). Cependant, les RMSD entre les monomères 5 et les monomères 6 sont légèrement plus grands (respectivement 1,49 Å et 1,40 Å), suggérant que cela est dû à l'interaction entre les régions CpcC (résidus 123–127 [cyan] et 197–204 [vert]) et celles des monomères 5 (résidus 14–17 [vert]) et 6 (résidus 113–122 [cyan]).

une carte cryo-EM de la tige PC (disque A et disque B). b Disposition des protéines de liaison (CpcC, CpcD et CpcG) dans la tige PC. c Structure de la tige PC en b tournée de 90˚.

a Superposition des parties supérieures du disque A. La protéine de liaison CpcD (résidus 55–65 [rouge dans « panneau 1 »] et 68–74 [vert dans « panneau 1 »]) interagit avec une région CpcB (résidus 109–122 [orange dans « panneau 1 »]) dans le monomère PC 3. b Superposition des parties inférieures du disque A. La protéine de liaison CpcC (résidus 123–1 27 [cyan dans "panel 2"] et 197–204 [vert dans "panel 3"]) interagissent avec les régions CpcB (résidus 14–17 [vert dans "panel 2"] du monomère PC 5 et 113–122 [cyan dans "panel 3"] du monomère PC 6, respectivement). c Superposition des parties supérieures du disque B. La "structure de type CpcD (résidus 234–287)" dans CpcC interagit avec une région CpcB (résidus 109–122, orange dans "panneau 4") dans le monomère PC 9. Le RMSD des régions (résidus 234–287) dans CpcC et CpcD est de 1,3. d Superposition des parties inférieures du disque B. La protéine de liaison CpcG2 (résidus 9 à 38 [vert dans le "panneau 5"]) interagit avec les régions des monomères 10 (résidus 78 à 90 et 109 à 122 [jaune dans le "panneau 5"]) et 11 (résidus 1 à 15 et 105 à 115 [jaune dans le "panneau 5"]). Les zones marquées "1 à 5" sont la vue agrandie des parties en interaction des protéines de liaison et de chaque monomère PC. Les modèles d'hélice et de surface transparente représentent des tiges de PC résolues par cryo-EM et cristallographie aux rayons X, respectivement. Les panneaux 1 à 6 montrent des vues agrandies des interactions de chaque trimère PC avec les protéines de liaison.

Notamment, la disposition des monomères dans le disque B est considérablement modifiée par rapport à celle des tiges de PC résolues par cristallographie aux rayons X (Fig. 7c, d). Ce réarrangement majeur s'est également produit dans la tige Nostoc 7120 PC, ce qui suggère fortement que cela est dû à l'interaction des protéines de liaison (CpcC et CpcG) dans le disque B. , respectivement. Le disque B (Fig. 7c) interagit avec CpcC et CpcG2, et la "structure de type CpcD (résidus 234–287)" dans CpcC interagit spécifiquement avec la région CpcB (résidus 109–122 [orange]) dans le monomère 9, cette interaction étant très similaire à celle entre CpcD et CpcB dans le monomère 3. Pour le disque B (Fig. 7d), comme dans le disque B (Fig. 7c), il y avait un changement significatif dans l'arrangement par rapport à la structure cristalline, à savoir les interactions entre les résidus de la région CpcG2 (résidus 9–38 [vert]) et les monomères 10 (résidus 78–90, 109–122 [jaune]) et 11 (résidus 1–15, 105–115 [jaune]) (Fig. 7d). Les protéines de liaison contribuent à la stabilisation structurelle des bâtonnets PC, et de nombreuses régions des protéines de liaison sont à proximité des chromophores dans les bâtonnets, ce qui suggère qu'elles contribuent également à affiner les niveaux d'énergie de ces chromophores.

De plus, nous avons superposé la tige PC de T. vulcanus et la tige PC Nostoc 7120 (Rs1: tige PC contenant CpcG2) à des fins de comparaison structurelle (Fig. 16 supplémentaire et tableau supplémentaire 7). Les structures globales sont très similaires, la disposition du disque A et du disque B dans la tige PC Nostoc 7120 étant différente de celle de la structure cristalline. Cela suggère que les interactions symétriques entre le trimère PC dans la structure cristalline sont dues à l'emballage cristallin. Une différence entre les deux tiges PC est que la tige PC Nostoc 7120 (Rs1) ne contient pas de CpcD, et la disposition du monomère PC à proximité de CpcD dans le disque A diffère de celle de la tige PC Nostoc 7120 (RMSD = 2,79), ce qui suggère que ce changement dans l'arrangement a été causé par l'interaction entre CpcD et CpcB dans le monomère 3 de T. vulcanus.

La disposition des chromophores, en particulier à la frontière entre les disques A et B dans la tige PC, diffère de celle déduite de l'emballage cristallin de la structure PC en raison de l'interaction avec les protéines de liaison (Fig. 8). CpcD (LR), un petit domaine de liaison de capuchon de tige, est la protéine de liaison la plus externe du PBS intact, et l'énergie d'excitation est transférée du disque A au disque B dans la tige PC. Semblable au noyau PBS, le couplage excitonique entre les chromophores contribue au transfert d'énergie dans les bâtonnets de PC. Cette interaction se traduit par un transfert d'énergie entre les monomères PC dans le trimère PC, de β155 à β84 et α84 à β8452. Les β84 du disque A et du disque B, qui interagissent avec CpcC, sont très proches l'un de l'autre dans l'hexamère PC de la tige PC, ce qui suggère que l'énergie d'excitation est transférée du disque A au disque B dans la tige PC via les chromophores (β84) interagissant avec CpcC (distances entre chromophores : 26–27 Å) (Fig. 8). Dans des études spectroscopiques précédentes de PC, il a été proposé que β84 dans une tige de PC interagissant avec des protéines de liaison soit impliqué dans le transfert d'énergie entre les hexamères de PC52,53,54. Par conséquent, six β84 (Fig. 8b) à la frontière entre les disques A et B sont probablement impliqués dans le transfert d'énergie entre les disques. Les résidus d'acides aminés caractéristiques autour des chromophores dans les protéines de liaison et les interactions entre ces résidus et les chromophores sont probablement cruciaux pour le transfert d'énergie unidirectionnel dans la tige PC.

a Disposition des chromophores dans la tige PC. α84, β84 et β155 sont respectivement colorés en cyan, vert et jaune. b Disposition des β84 dans une tige de PC interagissant avec des protéines de liaison. Les β84 à la frontière entre le disque A et le disque B sont colorés en vert, et ces chromophores sont impliqués dans le transfert d'énergie entre le disque A et le disque B. Les résidus d'acides aminés des protéines de liaison près des β84 sont indiqués en B.

En résumé, l'analyse cryo-EM du noyau PBS et de la tige PC de T. vulcanus (une structure hémidiscoïde chez de nombreuses espèces de cyanobactéries) a révélé l'arrangement des chromophores dans le PBS et sa structure environnante. Nous avons identifié trois trimères APC dans le cylindre A de T. vulcanus PBS, qui différaient de ceux observés dans le PBS d'autres espèces de cyanobactéries. La raison de cela reste incertaine et, par conséquent, des enquêtes détaillées sont nécessaires à l'avenir. Le cylindre C et ses structures environnantes dans le PBS de T. vulcanus et la structure globale d'ApcE, l'un des émetteurs terminaux, étaient très similaires à ceux du Nostoc 7120 PBS. En particulier, l'interaction entre le chromophore dans l'ApcE et le Trp est hautement conservée, et cette interaction est cruciale pour le transfert d'énergie du PBS au PSII. Cependant, les résidus d'acides aminés autour du chromophore diffèrent légèrement entre les espèces, ce qui suggère que cela reflète les différences de réglage fin du niveau d'énergie du chromophore entre les espèces. La structure globale des bâtonnets PC analysés par cryo-EM est différente des structures rapportées précédemment des bâtonnets PC (en particulier l'interaction entre les deux disques), qui est considérée comme étant due à l'interaction avec les protéines de liaison. Parce que les tiges de PC sont facilement dissociées du noyau PBS, il est difficile de clarifier la structure détaillée. Par conséquent, il est nécessaire non seulement d'analyser la structure du PBS intact, mais également d'analyser plus avant les bâtonnets de PC dissociés. Étant donné que les structures des PBS varient selon les espèces, les informations sur les structures des PBS fournissent une base pour les études sur l'évolution de la photosynthèse et la diversité de ses voies. À l'avenir, nous réaliserons des études mutationnelles, spectroscopiques et théoriques basées sur ces informations structurelles, ce qui nous aidera à approfondir notre compréhension de la fonction des PBS.

Des cellules de la cyanobactérie thermophile T. vulcanus NIES-2134 ont été cultivées dans un milieu phosphate55,56. Des PBS intacts et des noyaux de PBS ont été préparés selon les protocoles décrits par la réf. 26. Les membranes thylakoïdes, PSI et PSII ont été préparées selon les protocoles décrits par les réf. 55,56. Pour les tiges de PC, les PBS intacts ont été montés sur une grille de cuivre recouverte d'un film de carbone troué (voir "Préparation des échantillons et collecte de données pour cryo-EM" pour une description du prétraitement de la grille), puis une petite quantité de tampon contenant 10 mM de tampon phosphate a été rapidement ajoutée pour réduire la concentration de phosphate dans l'échantillon à moins de 0,5 M. Cela a entraîné la dissociation des tiges de PC des PBS intacts.

Les PBS intacts ont été colorés avec de l'acétate d'uranyle à 2 % (p/v) sur une grille revêtue de carbone pendant 1 min à 23 °C, et la solution restant sur la grille a été retirée avant séchage. Les grilles résultantes ont été transférées dans un microscope électronique (JM-2100 ; JEOL, Tokyo, Japon) fonctionnant à 200 kV. Les images ont été enregistrées à l'aide d'une caméra Oneview (AMETEK, Berwyn, PA, USA) à un grossissement nominal de 60 000 × (taille de pixel : 1,90 Å). Le traitement des données des images EM à coloration négative a été effectué à l'aide de RELION-3.1.057. Les paramètres de la fonction de transfert de contraste (CTF) ont été estimés à l'aide de CTFFIND4-1.1058 et les particules de PBS intactes ont été sélectionnées à l'aide de Xmipp359, un programme de sélection de particules sans référence. Au total, 9 358 particules ont été sélectionnées à partir de 249 images et soumises à la classification 2D sans référence à l'aide de RELION-3.1.0.

Pour clarifier la structure du noyau PBS et de la tige PC, des grilles pour cryo-EM ont été préparées de la manière suivante. Une grille de cuivre recouverte d'un film de carbone troué (Quantifoil R1.2 / 1.3 Cu 200 mesh; Microtools GmbH, Berlin, Allemagne) qui avait été prétraitée par pulvérisation Au a été déchargée pendant 10 s à l'aide d'un revêtement ionique (JEC-3000FC; JEOL, Tokyo, Japon). Pour le noyau PBS, 3,0 µL du noyau PBS ont été appliqués sur la grille et tamponnés avec du papier filtre pendant 4 s, puis immédiatement congelés par plongée dans de l'éthane refroidi à l'aide d'un FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) sous 100 % d'humidité à 4 °C. Pour la tige PC, 3,5 µL de l'échantillon purifié ont été appliqués sur la grille et dilués avec 1,5 µL de tampon phosphate 10 mM sur la grille. Ensuite, la grille a été buvardée et plongée manuellement dans de l'éthane refroidi à l'aide d'un piston fait maison. Les grilles ont ensuite été introduites dans un microscope électronique CRYO ARM 300 (JEOL) équipé d'un canon à émission à champ froid et d'un filtre d'énergie en colonne avec une largeur de fente de 20 eV. Les images fractionnées en dose ont été enregistrées à l'aide d'un détecteur d'électrons direct K2 Summit (AMETEK, Berwyn, PA, USA) en mode comptage. Toutes les images ont été corrigées à l'aide d'un système d'acquisition automatique de données JEOL60 avec un grossissement nominal de 40 000×, ce qui correspondait à une taille de pixel de 1,24 Å. Les plages de défocalisation nominales et les débits de dose pour le noyau PBS et la tige PC étaient de −0,5 µm à −1,5 µm et 84,1 e− Å−2 avec 50 images et de −0,5 µm à −1,5 µm et 50,5 e− Å−2 avec 30 images, respectivement. Au total, nous avons collecté 4600 et 2865 films pour le noyau PBS et la tige PC, respectivement.

Les piles de films collectées du noyau PBS ont été divisées en huit groupes d'optiques pour corriger les changements d'inclinaison du faisceau au fil du temps. La correction de la dérive et la sommation des images pondérées en fonction de la dose ont été effectuées à l'aide de MotionCor2-1.3.261, et les paramètres CTF ont été estimés à l'aide de CTFFIND4-1.1058. Les images ont été sélectionnées pour un traitement ultérieur des données sur la base des modèles d'anneaux Thon. Les particules de noyau de PBS ont été sélectionnées manuellement et soumises à une classification 2D sans référence par RELION-3.1.057 pour créer des images de référence pour la sélection automatique des particules. Au total, 128 676 particules ont été sélectionnées automatiquement et extraites avec une taille de pixel de 2,48 Å. De bonnes classes moyennes contenant 45 427 particules après classification 2D ont été soumises à une reconstruction tridimensionnelle (3D) ab initio dans cryoSPARC-2.12.062. Suite à la classification 3D dans RELION, une classe 3D bien alignée contenant 25 532 particules a été extraite avec une taille de pixel de 1,24 Å et utilisée pour un raffinement 3D supplémentaire avec une application de symétrie double. Le post-traitement dans RELION a produit une carte de résolution de 4,75 Å basée sur l'étalon-or FSC. Enfin, la résolution a atteint 3,71 Å après deux cycles de polissage bayésien et de raffinement CTF.

Pour PC12mer, toutes les piles de films ont été traitées à l'aide de MotionCor2-1.2.1 et Gctf-1.0663 pour la correction de la dérive, la sommation des images et l'estimation des paramètres CTF. Les 812 327 particules ont été sélectionnées par sélection de réseau neuronal convolutif à l'aide d'EMAN-2.3.164 et regroupées à une taille de pixel de 4,96 Å lors de l'extraction à l'aide de RELION-3.0. Après deux cycles de classification 2D, 309 291 particules ont été sélectionnées et soumises à la construction d'un modèle ab initio à l'aide de cisTEM-1.0.0 beta65. Les bonnes particules ont été automatiquement sélectionnées à nouveau avec une référence 3D à l'aide de l'EMAN-2.3.1. Au total, 159 537 particules d'une taille de pixel de 1,86 Å ont été sélectionnées parmi 1 022 349 particules sélectionnées sur la base de classifications 2D et 3D. Un raffinement 3D à l'aide de RELION-3.0 a été effectué, et après le polissage bayésien, le raffinement CTF et une classification 3D supplémentaire ont amélioré la résolution à 4, 19 Å avec 111 054 particules sans aucune application de symétrie. Pour plus de détails, voir les Figs supplémentaires. 4, 5 et tableau supplémentaire 1.

Les modèles initiaux du noyau PBS et de la tige PC de T. vulcanus ont été construits à l'aide de modèles de référence de PC et d'APC (codes PDB : 3O18 et 3DBJ) et une modélisation d'homologie a été réalisée sur le serveur SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) en se référant aux structures des protéines de liaison (codes PDB : 5Y6P et 6KGX). Les modèles obtenus ont été équipés des cartes cryo-EM à l'aide du programme "fit in map" dans UCSF Chimera (version 1.13), et des modèles initiaux du noyau PBS et de la tige PC ont été créés. Les modèles initiaux ont été modifiés manuellement à l'aide de COOT pour s'adapter à la carte cryo-EM et affinés à l'aide de Phenix (version 1.19.2). Par la suite, chaque sous-unité et ses sous-unités en interaction dans le noyau PBS et la tige PC ont été regroupées et affinées par rapport à la carte cryo-EM à l'aide de REFMAC5 (version 5.8.0267) dans CCP-EM. Enfin, les modèles regroupés ont été fusionnés en un seul, et les structures globales (noyau PBS et tige PC) ont été affinées à l'aide de Phenix. Les statistiques de raffinement des modèles raffinés ont été obtenues à l'aide du programme de validation complet de Phenix. Les contraintes nécessaires pour les ligands dans le noyau PBS et la tige PC de T. vulcanus ont été générées par le Ligand Bond Builder électronique et l'Optimization Workbench66. Les informations de retenue pour un Asn méthylé (ID de ligand : MEN) et la phycocyanobiline (ID de ligand : CYC) ont été obtenues à partir du modèle de MEN identifié dans une structure cristalline à haute résolution (code PDB : 3O18). La validation complète (dans Phenix), le Q-score39 et le FSC-Q67 ont été utilisés pour valider les modèles structurels affinés (noyau PBS et tige PC).

Sur la base de la disposition des PCB et de leur orientation dans le noyau PBS construit, un facteur d'orientation approximatif, κ2, a été estimé (tableau supplémentaire 6). Ces estimations ont été réalisées notamment pour les sites susceptibles d'être impliqués dans le transfert d'énergie entre cylindres du cœur PBS et pour les émetteurs terminaux. Le taux de transfert d'énergie d'excitation (kEET) est donné par l'équation. (1), où V et Θ sont respectivement le facteur de couplage électronique et l'intégrale de chevauchement.

Comme le montre la Fig. 11 (a) supplémentaire, les moments dipolaires de transition du donneur (D) et de l'accepteur (A) sont respectivement μD et μA. r est la distance centre à centre intermoléculaire entre D et A. V s'écrit par l'équation d'approximation [Eqs. (2) et (3)], et le facteur d'orientation (κ2) peut être estimé par l'Eq. (4).

L'orientation du moment dipolaire de transition des PCB a été déterminée en se référant à la réf. 68 (Fig. 11 et 12 supplémentaires).

Les spectres d'absorption de la membrane thylakoïde, du PSII, du PSII et du PBS ont été mesurés à 23 ° C à l'aide d'un spectrophotomètre UV-2600 (Shimadzu, Kyoto, Japon). Le spectre de la membrane thylakoïde a été mesuré en utilisant la méthode du verre opale.

Les polypeptides dénaturés au dithiothréitol ont été séparés sur un gel SuperSep contenant 10 à 20% d'acrylamide (Wako, Tokyo, Japon), puis colorés au bleu de Coomassie (Fig. 2c supplémentaire). Un système d'imagerie sur gel (système ChemiDoc XRS +; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a été utilisé pour photographier les gels colorés. Des polypeptides séparés (une bande contenant ApcC et CpcD) ont été identifiés par MS. Les bandes protéiques obtenues ont été traitées par digestion in situ à l'aide de trypsine69. Les peptides fragmentés ont été analysés par empreinte de masse peptidique et MS/MS en utilisant la vitesse Autoflex (Bruker Daltonik GmbH, Brême, Allemagne). Les spectres de masse obtenus ont été analysés en utilisant le serveur MASCOT (Matrix Science Inc., Boston, MA, USA).

Trente-huit séquences d'ApcE provenant de souches sélectionnées de cyanobactéries, de glaucophytes et de rhodophytes ont été obtenues par le programme blastp sur le site Web du NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Figs. 8 et 9 supplémentaires). Les séquences ont été alignées à l'aide de mafft (v.7.478) avec l'option L-INS-i70. L'arbre de vraisemblance maximale des séquences ApcE a été estimé à l'aide de iqtree2 (v.2.1.4) avec le modèle LG + F + R5 sélectionné par ModelFinder. Le support statistique des arbres a été estimé avec 1 000 réplications de l'approximation bootstrap ultrarapide71. L'organisation des domaines d'ApcE a été déterminée à l'aide du programme hmmscan dans HMMER (v.3.3.2 ; http://hmmer.org/) avec la base de données Pfam72. L'arbre phylogénétique et l'organisation des domaines ont été visualisés à l'aide d'iToL (v.473).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques et les cartes cryo-EM pour la structure rapportée du noyau PBS et de la tige PC de Thermosynechococcus vulcanus ont été déposées dans la banque de données sur les protéines sous les codes d'accession 7VEA (noyau PBS) et 7VEB (tige PC), et dans la banque de données de microscopie électronique sous les codes d'accession EMD-31944 (noyau PBS) et EMD-31945 (tige PC), respectivement. Les graphiques et les chiffres générés dans cette étude sont fournis dans le fichier Informations supplémentaires/Données source. D'autres données sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies dans ce document.

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Nous remercions les assistantes de recherche Mme Yuko Kageyama (Laboratoire de mécanismes biostructuraux, RIKEN SPring-8 Center) et Mme Rie Uno (Université métropolitaine d'Osaka) pour leur aide dans les cultures cellulaires, la préparation des échantillons, l'analyse par électrophorèse et la spectroscopie. Nous remercions également Mme Tomomi Shimonaka de la Graduate School of Science, Osaka City University, pour avoir effectué la spectrométrie MS/MS. Ce travail a été soutenu par la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (JP20H05109 (à KK), JP20K06528 (à KK) et JP17H06434 (à NK)) et en partie par le Joint Usage/Research by Institute of Industrial Nanomaterials, Kumamoto University. Numéro de subvention du programme JST-Mirai JPMJMI20G5 (à KY) et l'innovation cyclique pour l'autonomisation clinique (CiCLE) de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux, AMED (à KK, TH et KY).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Keisuke Kawakami, Tasuku Hamaguchi.

Laboratoire de mécanismes biostructuraux, Centre RIKEN SPring-8, 1-1-1, Sayo, Hyogo, 679-5148, Japon

Keisuke Kawakami, Tasuku Hamaguchi et Koji Yonekura

Institut de recherche interdisciplinaire inspiré de l'électronique, Université de technologie de Toyohashi, 1-1 Tempaku, Toyohashi, Aichi, 441-8580, Japon

Yuu Hirose

Institut des nanomatériaux industriels, Université de Kumamoto, Kumamoto, 860-8555, Japon

Daisuke Kosumi

École supérieure des sciences, Université métropolitaine d'Osaka, Osaka, 558-8585, Japon

Makoto Miyata

The OCU Advanced Research Institute for Natural Science & Technology (OCARINA), Université métropolitaine d'Osaka, Osaka, 558-8585, Japon

Nobuo Kamiya

Advanced Electron Microscope Development Unit, RIKEN-JEOL Collaboration Center, RIKEN Baton Zone Program, Hyogo, 679-5148, Japon

Koji Yonekura

Institut de recherche multidisciplinaire sur les matériaux avancés, Université du Tohoku, Miyagi, 980-8577, Japon

Koji Yonekura

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KK et NK ont conçu l'étude ; KK a préparé les échantillons et effectué une analyse par électrophorèse ; KK a effectué des mesures spectroscopiques, KK a effectué la mesure et l'analyse de l'EM de coloration négative ; TH a mesuré les micrographies EM, et TH et KK ont traité les données EM (noyau PBS : TH ; tige PC : KK) et ont reconstruit la carte EM finale (noyau PBS : TH ; tige PC : KK) ; KK a effectué une analyse structurelle ; YH a effectué une analyse d'arbre phylogénétique; DK commente les analyses de données ; KY, NK et MM ont supervisé le projet ; KK, TH et KY ont rédigé le projet de manuscrit ; KK, TH et KY ont révisé le manuscrit final ; et tous les auteurs ont contribué à l'interprétation des résultats et à l'amélioration du manuscrit.

Correspondance à Keisuke Kawakami ou Koji Yonekura.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Noam Adir, Florent Waltz et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Kawakami, K., Hamaguchi, T., Hirose, Y. et al. Structures de noyau et de tige d'un phycobilisome thermophile cyanobactérien récoltant la lumière. Nat Commun 13, 3389 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30962-9

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Reçu : 28 octobre 2021

Accepté : 24 mai 2022

Publié: 17 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30962-9

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